瀏覽數(shù)量： 0 作者： 本站編輯 發(fā)布時間： 2025-04-28 來源： 本站
實驗室超常用的蛋白濃度測定方法，看這一篇就夠了！選對方法，實驗效率倍增！
Part1 紫外吸收法(A280法)
蛋白質中的色氨酸（Trp）酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）殘基在280nm附近有紫外吸收峰通過測量蛋白質溶液在 280 nm 處的吸光度值，可以估算蛋白質濃度基于Beer-Lambert定律：A=εbc，其中A是吸光度，ε是摩爾消光系數(shù)，b是光程，c是濃度對于蛋白質，ε和b在特定條件下可以視為常數(shù)，因此吸光度A與濃度c成正比通常假設蛋白質的平均消光系數(shù)ε約為1.0(mg/mL)^-1 cm^-1
The merits of this method 優(yōu)點
快速簡便
操作非常簡單快捷，只需使用紫外分光光度計直接讀取280nm處的吸光度即可
非破壞性
樣品可以回收，因為測量過程中樣品沒有被化學修飾或消耗
不需要試劑
除了緩沖液，不需要額外的化學試劑
適用于高濃度蛋白質
在高濃度范圍內(nèi)也相對準確
The demerits of this method 缺點
干擾多
核酸(DNA,RNA)在 260 nm 處也有很強的紫外吸收，在 280nm 處也有一定吸收，會干擾蛋白質的測定其他一些小分子物質也可能在 280 nm 處有吸收，造成結果偏差
靈敏度較低
對于低濃度的蛋白質溶液，吸光度值可能太低，誤差較大
準確性受蛋白質組成影響
不同蛋白質的色氨酸和酪氨酸含量差異很大，導致其摩爾消光系數(shù)差異也很大使用平均消光系數(shù)進行估算，準確性會受到蛋白質自身氨基酸組成的影響如果蛋白質樣品中Trp 和 Tyr 含量異常高或異常低，誤差會更大
需要純凈樣品
樣品中不能含有大量干擾紫外吸收的物質，如核酸某些染料等
Part2 考馬斯亮藍法（Bradford法）
考馬斯亮藍G-250染料在酸性條件下與蛋自質結合，染料從紅色形式（最大吸收波長在465 nm）轉變?yōu)樗{色形式（最大吸收波長在595 nm）這種顏色的轉變是由染料與蛋白質結合后，染料分子結構發(fā)生變化引起的結合主要是通過靜電相互作用和范德華力，特別是染料的磺酸基團與蛋白質的堿性氨基酸殘基（如精氨酸賴氨酸和組氨酸）以及芳香氨基酸殘基的非極性區(qū)域相互作用顏色的深淺（在595 nm 處的吸光度）與蛋白質濃度成正比
merits of this method 優(yōu)點
靈敏度較高
比紫外吸收法靈敏度高，適用于測定較低濃度的蛋白質
操作簡便快捷
試劑單一，操作步驟少，反應迅速，通常幾分鐘內(nèi)即可完成
受樣品中鹽和緩沖液干擾小
相對于其他比色法，受樣品中常見的鹽緩沖液等干擾較小
穩(wěn)定性好
染色后的藍色復合物在室溫下可以穩(wěn)定一段時間，方便讀取數(shù)據(jù)
demerits of this method 缺點
標準曲線依賴性
需要使用已知濃度的標準蛋白質(通常是牛血清白蛋自BSA)制作標準曲線，才能定量不同蛋白質與染料的結合能力有所差異，因此使用 BSA標準曲線測定其他蛋白質，結果可能存在偏差
蛋白質種類依賴性
不同蛋白質與染料的結合能力不同，導致對不同蛋白質的定量結果準確性不同堿性氨基酸和芳香氨基酸含量高的蛋白質測定結果相對準確，反之則可能偏差較大
試劑會染色比色皿
考馬斯亮藍染料容易染色玻璃或塑料比色皿，需要小心操作，或者使用一次性比色皿
線性范圍有限
在較高蛋白濃度下，反應可能出現(xiàn)飽和，導致標準曲線非線性
對去垢劑敏感
一些去垢劑，如SDS，會干擾Bradford反應
Part3 Lowry法
Lowry法是一種經(jīng)典的蛋白質定量方法，基于兩個連續(xù)的化學反應第一步是蛋白質中的肽鍵與銅離子在堿性條件下反應，形成復合物，銅離子被還原為亞銅離子第二步是還原的亞銅離子還原FolinCiocalteu試劑(磷鉬酸和磷鎢酸的混合物)，使試劑顯色，產(chǎn)生藍色顏色的深淺(通常在750nm或660nm處測量吸光度)與蛋白質濃度成正比
merits of this method 優(yōu)點
靈敏度較高
比紫外吸收法和 Bradford 法更靈敏，可以檢測更低濃度的蛋白質
受蛋白質組成影響相對較小
因為是基于肽鍵反應，受不同蛋白質氨基酸組成的影響比 Bradford 法小一些
demerits of this method 缺點
操作步驟繁瑣
需要多個試劑，操作步驟較多，耗時較長
試劑不穩(wěn)定
Folin-Ciocalteu 試劑不穩(wěn)定，容易受還原性物質污染，需要臨用前配制
干擾多
容易受到多種化學物質的干擾，包括一些緩沖液成分（如Tris，EDTA），以及非離子型去垢劑還原劑等需要嚴格控制樣品和試劑的純度
時間依賴性
顯色反應需要精確控制反應時間和溫度，反應時間過長或過短都會影響結果的準確性
標準曲線依賴性
同樣需要使用標準蛋白質制作標準曲線
Part4 BCA法
BCA法原理與Lowry法類似，也是基于兩個步驟的反應第一步是蛋白質中的肽鍵將銅離子 在堿性條件下還原為亞銅離子 第二步是亞銅離子與 BCA試劑(二喹啉甲酸)反應，形成紫色的 BCA-Cu*復合物，該復合物在 562nm 處有最大吸收顏色的深淺與蛋白質濃度成正比
merits of this method 優(yōu)點
靈敏度高
與 Lowry 法靈敏度相當，比 Bradford 法和紫外吸收法高
操作相對簡便
試劑相對穩(wěn)定，通常試劑以預混形式提供，操作步驟比Lowry 法簡化
受去垢劑干擾小
相對于 Lowry 法，受一些去垢劑(如 SDS,Triton X-100)的干擾較小，更適用于含有去垢劑的樣品
線性范圍較寬
BCA法的線性范圍比 Bradford 法寬
穩(wěn)定性好
顯色后的復合物比 Bradford 法更穩(wěn)定，可以放置較長時間再讀取數(shù)據(jù)
demerits of this method 缺點
標準曲線依賴性
需要使用標準蛋白質制作標準曲線
銅離子還原反應
基于銅離子還原反應，容易受到還原性物質的干擾
時間和溫度依賴性
反應需要加熱孵育，結果受時間和溫度影響
對脂類物質敏感
脂類物質會干擾 BCA反應
Part5 雙縮脲法
雙縮脲法是最早用于蛋白質定量的方法之一在強堿性條件下，含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物(包括蛋白質)可以與銅離子反應，形成紫紅色的絡合物這種絡合物的最大吸收波長在540nm左右顏色的深淺與蛋白質濃度成正比
merits of this method 優(yōu)點
受蛋白質組成影響最小
因為是直接與肽鍵反應，受不同蛋白質氨基酸組成差異的影響最小，對不同蛋白質的定量相對比較準確
干擾少
受樣品中常見的鹽緩沖液以及一些小分子物質的干擾較小
demerits of this method 缺點
靈敏度低
相對于 Bradford法Lowry法和BCA法，靈敏度最低，通常只能用于測定較高濃度的蛋白質(>1mg/mL)
需要大量樣品
由于靈敏度低，需要較高濃度的蛋白質樣品和較大量樣品才能獲得可讀的吸光度值
操作步驟較多
需要配置試劑，操作步驟相對繁瑣
標準曲線依賴性
需要使用標準蛋白質制作標準曲線
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